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本制品是一种使用对单线态氧具有高度选择性的绿色荧光探针SOSG，进行3D培养的细胞球或类器官中单线态氧检测的试剂盒。本试剂盒可快速、便捷地用于3D培养的细胞球或类器官中单线态氧检测。通常仅需染色20分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞球或类器官中单线态氧绿色荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。

活性氧(ROS)是分子氧化还原过程中的一系列中间产物，是一类化学性质活泼具有较高氧化活性的分子或离子的总称。单线态氧(1O2)是活性氧的一种，可通过细胞代谢、氧化还原反应、光敏化等途径产生，能够破坏生物细胞成分，如脂质、蛋白质以及核酸等，在生物学、医学、材料和化学等领域得到了广泛的关注。虽然单线态氧是一种强氧化试剂，但细胞内存在的多种抗氧化酶和抗氧化剂能发挥相应的抗氧化机制而使其失活，因此在正常细胞中，自然产生的单线态氧以及其它ROS不会对细胞内的细胞器造成明显的损伤。

SOSG是对单线态氧高度选择性结合的探针，对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(·O₂^-)及一氧化氮(NO)无任何明显的反应。与单线态氧反应前，SOSG自身具有微弱的蓝色荧光，激发峰在372nm和393nm，发射峰在395nm和416nm；与单线态氧反应后，生成的SOSG内过氧化物(SOSG-EP)发出类似于荧光素(Fluorescein)的绿色荧光，最大激发光波长为504nm，最大发射光波长为525nm。

本试剂盒组分齐全，使用方便。本试剂盒提供单线态氧阳性对照试剂By3D SOup可短时诱导细胞单线态氧生成。同时，本试剂盒提供By3D SOSG Assay Buffer，使用更方便。本试剂盒也提供了Hoechst 33342染色液，方便同时观察细胞核染色情况。

• 适用范围广：本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
  
• 使用便捷：整个检测过程仅需约30分钟即可完成。3D细胞球经单线态氧阳性对照试剂By3D SOup等诱导处理后，将本试剂盒中的By3D SOSG按照相应比例用By3D SOSG Assay Buffer配制成By3D SOSG检测工作液，避光孵育20分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。

组分	规格
By3D SOSG	100μg
By3D SOup (500×)	60μL
By3D Hoechst 33342 (100×)	350μL
By3D SOSG Assay Buffer	35mL

保存：-20℃，避光，有效期1年。

• By3D SOup (500×)和By3D Hoechst 33342 (100×)第一次使用时请适当分装后-20℃保存，避免反复冻融。
  
• By3D SOSG Assay Buffer经过过滤除菌处理，在使用时必须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果By3D SOSG Assay Buffer发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。
  
• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
  
• 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
  
• 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
  
• 不同种类的细胞球对诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经单线态氧诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。

本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。

• 3D细胞的准备：在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用GoldBalb超低吸附96孔板(YTC4962或YTC4961)、超低吸附黑色透明底96孔板等。如果后续用于荧光酶标仪检测，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
  
  • 为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于SF268细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预和染色效果较好。
• By3D SOSG储存液的配制：取100μg本制品溶解于33μL甲醇中，即得约5mM的By3D SOSG储存液。
  
  • 由于微量的By3D SOSG可能会附着在离心管管壁或管盖内，所以在打开管盖前，建议在离心机中约8000～12000×g离心10～30秒，使附着在管盖或管壁上的By3D SOSG聚集于管底。
  • By3D SOSG储存液适当分装后-80℃储存，建议一个月内使用。
• 3D细胞SOSG检测工作液的配制：
  
  • By3D SOSG检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D SOSG检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
    
  • By3D SOSG检测工作液的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μL By3D SOSG检测工作液的量，用By3D SOSG Assay Buffer稀释配制适量的By3D SOSG检测工作液。
    

    样品数	10个样品	50个样品	100个样品
    By3D SOSG (5mM)	1μL	5μL	10μL
    By3D Hoechst 33342 (100×)	10μL	50μL	100μL
    By3D SOSG Assay Buffer	989μL	4.945mL	9.89mL
    By3D SOSG检测工作液	~1mL	~5mL	~10mL

    • 配制By3D SOSG检测工作液时注意避光，且需现配现用，不能长期保存。
    • By3D SOSG最优先的推荐终浓度为1×，对大多数细胞都适用。但为了得到满意的结果，对于不同类型的细胞请自行进行一定的摸索，By3D SOSG的终浓度通常为0.5～2×。
    • Hoechst 33342染色为选做。为了方便观察每个细胞，可以考虑使用Hoechst 33342进行细胞核染色。
    • 本试剂盒配套提供的By3D SOSG Assay Buffer可在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果通常比PBS或HBSS更好。
• 阳性对照的设置：将试剂盒中提供的单线态氧阳性对照试剂By3D SOup (500×)按照1:500的比例酌情使用PBS或无血清细胞培养液稀释，通常处理细胞60分钟即可，具体处理时间可以根据细胞种类适当调整。随后按照下述各种检测方法的步骤加入By3D SOSG检测工作液，进行检测。
  
  • 单线态氧阳性对照试剂可短时间内诱导细胞单线态氧生成，终浓度通常为0.5～2×，最优先的推荐终浓度为1×。
  • 仅在阳性对照孔内加入By3D SOup作为阳性对照，其余孔内不必加入By3D SOup。
  • By3D SOup实测对于3D培养的SF268、A172、NRK-52E细胞球有良好效果，但可能对3D培养的HCT-116、HeLa、L929等某些细胞效果微弱或者完全没有效果。
• 染色和检测：
  
  • 染色：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μL By3D SOSG检测工作液。通常96孔板每孔加入100μL，37℃避光孵育20分钟。孵育时间可在10～30分钟之间进行调整。
    
    • 如果是首次实验不能确定孵育时间，建议先尝试37℃孵育20分钟，观察荧光效果。如果正常细胞染色较深，则适当缩短时间；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
  • 检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察染色效果，或用荧光酶标仪检测，SOSG-EP为绿色荧光，Ex/Em=504/525nm。
    
    • 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
    • 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。

图1.本试剂盒对于3D培养的SF268 (人胶质母细胞瘤细胞)的染色效果图。5000个SF268细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养72小时，1×By3D SOup诱导细胞球1小时，然后吸除培养液后直接加入1×的By3D SOSG检测工作液，染色20分钟。结果显示，本试剂盒对于By3D SOup诱导后的3D细胞染色效果清晰、明亮，By3D SOSG染色的对照组细胞无明显阳性染色(B、F)，Hoechst 33342染色的细胞核总体基本一致(C、G)。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
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